Month: October 2020

October 19, 2020

Protokół chromatografii z filtracją żelową

Uruchomienie kolumny wykluczenia rozmiaru Nakładanie próbkiWlej koraliki w szklany pręt (umieszczony na środku tuby)Pozwól kulkom osiąść, a następnie podłącz do niego górny zbiornik buforuPrzepłucz bufor jeszcze dwa razy (zalecają siedem objętości kulek do wstępnego przemycia i przemycia między próbkami)Zmierz objętość łóżka (tj. Wysokość kulek)Niech bufor biegnie na górę kolumnyZatrzymaj kolumnęUmieść gumową rurkę wokół pipety PasteuraPowoli nałóż próbkę w dół kolumnyNiech próbka popłynie na szczyt kolumnyZatrzymaj […]

October 19, 2020

Protokół wirowania w gradiencie sacharozy (sedymentacja prędkości) dla makrocząsteczek, takich jak białka

Cel: Oddzielenie różnych rozmiarów makrocząsteczek, takich jak białka; może być stosowany jako forma oczyszczania białek Przygotowanie gradientowe Za pomocą P1000 odmierzyć pipetą 500 uL 20% roztworu sacharozy na dno każdej cienkościennej probówkiZa pomocą P200 odpipetować 500 μl każdego z kolejnych stężeń sacharozy (15, 10, 5%)Pipetuj powoli, umieszczając końcówkę pipety nieco poniżej cieczy i powoli przesuwając ją w góręPozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, zakryć, […]

October 19, 2020

Protokół o tym, jak rozpuszczać białka błonowe za pomocą CHAPS

Przemyć komórki lodowatym PBS. Zawieś ponownie komórki w lodowatym buforze TE (10 mM Tris, pH 7,4, 2 mM EDTA). Umyć 2x w lodowatym TE (wirować przy 40 000 x g, za każdym razem 8 minut). Do 36 mM CHAPS w PBS, mieszając w niskiej temperaturze (np. Na lodzie lub w chłodni), dodaj kroplami komórki, które są ponownie zawieszone w ~ 1 ml buforu TE. Rozpuścić […]

October 19, 2020

Solubilizacja białek błonowych z protokołem Triton X-100

Wymagane rozwiązania:10 mM Tris, 2 mM EDTA (bufor TE) 2% Triton w PBS (sporządzić roztwór podstawowy 20% Triton X-100, odważając 2 g Triton X-100, dodając PBS do 10 ml, kołysząc lub delikatnie mieszając przez noc; przechowywać roztwór podstawowy w lodówce w 4 stopniach C). Zawieś ponownie komórki w buforze TE. Prać 2x w TE (wirować przy 40 000 x g, za każdym razem 8 minut). […]

October 19, 2020

Protokół reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

Podkłady można przechowywać w lodówce o 4 stopniach, jeśli nie są ponownie zawieszone w wodzieprzy ponownym umieszczaniu w wodzie użyj wody jałowejpodczas otwierania probówki należy robić to delikatnie, aby zapobiec rozproszeniu liofilizowanych primerówdodaj tyle wody, aby uzyskać 100 μmol / μl LUB 1ug / μlrozcieńczyć zapas podkładu do 10 pmol / ul lub 100 ng / ul, aby uzyskać roztwór roboczy Dołącz kontrolę negatywną z […]

October 19, 2020

Projektowanie podkładów – lista kontrolna

Czy temperatury hybrydyzacji każdej pary starterów dla odpowiedniego produktu PCR są podobne? Czy podkład masegment do wyżarzania?segment tagu?miejsce dla enzymu restrykcyjnego?dodatkowe podstawy, które pomogą wyciąć miejsce restrykcyjne? Czy starter jest w prawidłowej orientacji (jeśli to konieczne, czy jest w odwrotnym dopełnieniu? Jeśli to konieczne, czy dodatkowe zasady [d] są w odwrotnym dopełnieniu?) Czy temperatura wyżarzania wynosi co najmniej 50 stopni Celsjusza?