automatyka-robotyka
October 19, 2020

Protokół reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

By Pawel

Podkłady można przechowywać w lodówce o 4 stopniach, jeśli nie są ponownie zawieszone w wodzie
przy ponownym umieszczaniu w wodzie użyj wody jałowej
podczas otwierania probówki należy robić to delikatnie, aby zapobiec rozproszeniu liofilizowanych primerów
dodaj tyle wody, aby uzyskać 100 μmol / μl LUB 1ug / μl
rozcieńczyć zapas podkładu do 10 pmol / ul lub 100 ng / ul, aby uzyskać roztwór roboczy

Dołącz kontrolę negatywną z szablonem DNA zastąpionym wodą (być może użyj mieszanki głównej)

Do cienkościennych probówek do PCR 0,5 ml (nie mieszaj tego z innymi probówkami 0,5 ml),
dodaj w tej kolejności:
Szablon DNA 5uL
woda do 50 ul
10x bufor polimerazy 5uL
dNTP 0,5uL (z mieszanki równych ilości np. 1,25uL)
Podkład 1 1uL 10 pmol / ul
Podkład 2 1uL 10 pmol / ul
zatrzymać

Włącz maszynę 5 minut przed biegiem
Uruchom program
Poczekaj, aż pokrywa osiągnie maksymalną temperaturę
Pauza
Dodaj 1uL enzymu do próbek, pipetuj 6x w górę iw dół, wymieszaj palcami
Naciśnij ponownie pauzę, aby rozpocząć program
(Należy pamiętać, że każda maszyna może się różnić pod względem obsługi.)

Program PCR
Krok 1: 2 min. 95 ° C
Krok 2: 1 min. 95 ° C
Krok 3: 1 min. średnia temperatura topnienia części do wyżarzania 2 podkładów
Krok 4: 1 min. 72 ° C
Krok 5: Przejdź 4x do kroku 2
Krok 6: 1 min. 95 ° C
Krok 7: 1 min. średnia temperatura topnienia na całej długości 2 podkładów
Krok 8: 1 min. 72 ° C
Krok 9: Przejdź do kroku 6 34x
Krok 10: 5 min. 72 ° C
Krok 11: na zawsze 4 ° C

jeśli temperatury topnienia obu primerów są podobne, nie ma potrzeby dzielenia programu na 2 rundy cykli

uruchomić produkt PCR na żelu i wyciąć i oczyścić właściwy prążek przed trawieniem, alternatywnie, PCR można oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, jeśli jesteś zajęty czymś innym